利用重組菌表達生產外源蛋白產物已經成功走向商業化的道路。近年來，作為真核細胞的酵母表達系統，是繼大腸桿菌表達系統后最為流行的一種表達系統。相比于哺乳動物和昆蟲細胞系統，畢赤酵母表達系統有著更高的效益。目前，甲醇營養型畢赤酵母 (Pichia pastoris)是一種較為普遍的酵母表達系統，它的兩個基因 AOX1 和 AOX2 都可以編碼醇氧化酶（AOX），利用甲醇誘導可以啟動 AOX1基因的信號轉錄和翻譯。畢赤酵母最重要的特點是可以利用甲醇作為唯一碳源，將嵌入 AOX1 的外源蛋白基因表達出來，根據利用甲醇的能力，可以將細胞分為甲醇利用快型菌(Methanol utilization plus, Mut+，AOX1 與 AOX2 基因完好，可快速利用甲醇，其代表為 GS115 菌株)，甲醇慢速利用型菌(Methanol utilization slow, Muts，利用甲醇的 AOX1基因遭到破壞，AOX2 基因完好，因此甲醇利用能力下降，易出現甲醇中毒現象，其代表為 KM71 菌株)，和非甲醇依賴型菌 (Methanol utilization minus , Mut-，不能表達醇氧化酶，甲醇不作為碳源只作為誘導劑少量添加)。
畢赤酵母生產外源蛋白時，由于外源基因被整合在 AOX1 啟動子上，因此，它具有如下優點：AOX1 啟動子有強啟動性和強誘導性；分泌的糖蛋白的糖基化位點與哺乳類細胞相同，具有可進行磷酸化、脂酞化和蛋白折疊，形成二硫鍵等典型的真核生物細胞翻譯后的修飾功能，因此免疫原性較低，分泌的動物和人源蛋白臨床應用更佳；表達效率高，一般情況下所分泌的外源蛋白占總蛋白的比例都超過 30%；外源基因遺傳穩定；可高密度發酵，生產放大比較簡單。因此，該表達系統在醫藥蛋白或抗體藥物、食品、動物飼料添加劑生產上都有廣泛的應用。
然而畢赤酵母表達外源蛋白的發酵過程存在著一些不利于生產的特征：發酵生產過程氧耗大、能耗大，操作成本高；蛋白表達過程有強烈的時變特征，高產穩產不易，發酵周期長；細胞容易衰亡、代謝活性難以長期維持，蛋白表達難以持續積累。因此需要進一步探尋可提高發酵性能的策略和手段。
利用重組畢赤酵母生產外源藥物蛋白分成兩個階段：細胞生長階段和甲醇誘導表達蛋白階段。在這兩個階段，菌體使用的碳源類型不同。細胞生長階段，重組畢赤酵母生長情況類似于其他酵母，該階段控制策略的主要目標就是提高固定培養時間內的菌體濃度，為實施后續的蛋白誘導表達打下基礎。該階段還可再細分為甘油分批和流加培養兩個子階段，主要目的是為了防止高濃度甘油對菌體生長的抑制，在生長階段后期進行甘油限制性流加。與外源蛋白產量和質量直接相關的是第二階段，該階段隨著誘導劑甲醇的加入，AOX 啟動子被激活，隨之翻譯和轉錄嵌入在 AOX 基因上的外源蛋白。
甲醇進入到畢赤酵母細胞內的過氧化物酶體后，在醇氧化酶（AOX）的催化作用下與 O2發生反應，生成甲醛（HCHO）。一部分甲醛離開過氧化物酶體進入細胞質，在甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶作用下，最終氧化生成 CO2。此時 1 mol 甲醇完全氧化可以生成2 mol 的還原型輔酶 NADH 和 1 molCO2。另外一部分甲醛則在過氧化酶體內的二羥基丙酮合成酶（DHAS）催化下與 5-磷酸木酮糖反應，生成二羥基丙酮（DHA）和 3-磷酸甘油醛（GAP）。DHA 和 GAP 進入細胞質后，分別在二羥基丙酮激酶、1,6-二磷酸果糖醛縮酶和 1,6-二磷酸果糖磷酸酶的作用下，或進入到戊糖途徑 HMP，或經糖酵解途徑EMP 轉變為丙酮酸后再進入到 TCA 循環。上述過程還伴隨有大量能量物質的生成，可為菌體生長、維持代謝和蛋白合成提供所需的前體物質和能量物質。
關于細胞利用甲醇的代謝分配比問題，主要存在著兩種看法。Veenhuis等認為，細胞利用大部分甲醇異化供能，少部分甲醇則進入 TCA 循環，為合成目標蛋白提供所需的前體物質。這種觀點被許多學者廣泛接受和認可。同時，也有一些學者如 Sibirny等認為，甲醇異化代謝途徑的主要作用只是保護細胞不因大量甲醇的殘留而中毒，絕大部分甲醇進入到了 TCA 循環的供能和蛋白合成途徑。但是，文獻并沒有闡述主要產能途徑是否受外界環境的影響。
探討甲醇型畢赤酵母表達系統的多種表達策略以及效果一直是國內外論文研究的重點。除了對酵母菌自身進行分子改造，發酵過程的優化與控制也是有效實施表達策略、提高發酵性能的重要手段。發酵控制策略包括但不局限于：1）通過實驗數據建立細胞生長模型或甲醇消耗模型，構建流加控制系統；2）開發或改善各類實時監測發酵表觀參數的設備，如研發更精確的甲醇在線檢測器等；3）使用共混流加誘導等方法改善細胞對甲醇的適應能力。由于甲醇濃度、pH 最佳控制水平、低溫誘導的作用、以及非限制性碳源與甲醇的共混流加誘導等因素對不同菌種和目標產物具有特異性，該領域的研究和報道較為集中。
課題組前期研究工作表明降低誘導溫度可以顯著提高目標蛋白 pIFN-α 在畢赤酵母中的產量和抗病毒活性。在 Dragosis 等文中,通過轉錄水平的檢測發現，以葡萄糖為培養基時,TCA 循環在低溫下處于上調水平，但文獻并未闡述這一發現對蛋白合成能量供應的正面作用。而另一種畢赤酵母發酵優化策略—誘導期混加山梨醇在規模化生產中具有更易于操作的優勢。 Celik E 等人指出，誘導期山梨醇的添加可以起到多重作用：縮短細胞對甲醇誘導環境的適應時間，降低細胞死亡率，進一步提高細胞濃度，消除乳酸積累和提高氧的利用能力等。汪志浩等人在研究中發現，以山梨醇作為輔助碳源，混合甲醇進行誘導優于其他碳源的混合誘導。因此，甲醇/山梨醇共混流加誘導的方法也被廣泛采用。
